Fluorescein nachází uplatnění v medicíně např. při kontrastním vyšetření cév uvnitř oka (v oční sítnici nebo duhovce). Pacientovi je do žíly na ruce zavedena kanyla, do které je následně aplikován fluorescein. Fyziologicky fluorescein neprostupuje stěnou sítnicových cév, ale prostupuje stěnou poškozených cév, čímž lze získat informaci o úrovni poškození sítnice.

     Další využití má fluorescein při stopování podzemních vod. Tradičně se fluorescein používá v hydrogeologickém výzkumu krasových oblastí.